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ATP含量檢測(cè)試劑盒 微量法

ATP 含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷8三樓
英文名稱(chēng):ATP content detection kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC0305
規(guī)格：100T/96S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：1560
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：ATP含量檢測(cè)|ATP含量|ATP|

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入3.5mL 蒸餾水充分溶解，可加熱促進(jìn)溶解；
試劑三：液體4mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前每支加入0.4mL 蒸餾水溶解，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入1mL 蒸餾水；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入0.5mL 蒸餾水備用，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，-20℃保存。5mg ATP，臨用前加入0.826mL 蒸餾水配成10μmol/mL 的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：
ATP 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定ATP 含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。
HK 催化葡萄糖和ATP 合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH，NADPH 在340nm 有特征吸收峰，NADPH 和ATP 含量成正比，以此反應(yīng)ATP 含量。

自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/ 96 孔UV 板、研缽/勻漿器、蒸餾水和lv仿。

操作步驟：
一、ATP 的提取：
1、血清（漿）中ATP 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積（mL）為1：5~10 的比例（建議取約0.1mL 血清（漿），加入1mL 提取液），充分震蕩，10000g，4℃離心10min；取上清液另一EP 管中，加入500μL 的lv仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

2、組織中ATP 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清另一EP 管中，加入500μL 的lv仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。
3、細(xì)胞或細(xì)菌中ATP 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，超聲2s，停1s），10000g 4 ℃離心10min；取上清液另一EP 管中，加入500μL 的lv仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

二、測(cè)定步驟：
1、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將10μmol/mL 的ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋16 倍即0.625 μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、工作液的配制：臨用前請(qǐng)按試劑二(mL)：試劑三(mL)：試劑四(mL)：試劑五（mL）：試劑六(mL)=1：1：0.1：0.4：0.1 的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。
4、加樣表
在微量石英比色皿或96 孔UV 板中加入：
試劑名稱(chēng)(μL)          測(cè)定管          標(biāo)準(zhǔn)管
樣本                   20
標(biāo)準(zhǔn)液                                 20
試劑一                128             128
工作液                 52              52

充分混合后，立即測(cè)定340nm 下10s 的吸光值A(chǔ)1，然后將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）水浴中反應(yīng)3min，拿出擦拭干凈立即測(cè)定其在3min10s 時(shí)的吸光值A(chǔ)2。用96 孔板則放入37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）培養(yǎng)箱中（酶標(biāo)儀若自帶控溫功能，則將溫度調(diào)37℃或25℃）。分別計(jì)算ΔA 測(cè)定=A2 測(cè)定管-A1 測(cè)定管，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A2標(biāo)準(zhǔn)管-A1 標(biāo)準(zhǔn)管

三、ATP 含量計(jì)算：
1、血清（漿）中ATP 含量計(jì)算
ATP 含量(μmol/mL) =ΔA 測(cè)定÷（ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×（V 提取+V 血清（漿））÷V 血清（漿）=6.875×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP 含量計(jì)算
（1） 按樣本鮮重計(jì)算
ATP 含量（μmol/g 鮮重）= ΔA 測(cè)定÷（ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×V 提取÷W=0.625×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷W
（2） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
ATP 含量(μmol/106 cell）=ΔA 測(cè)定÷（ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×V 提取÷5=0.125×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，0.625μmol/mL；
V 提?。杭尤氲奶崛∫后w積，1mL；
V 血清（血漿）：血清（漿）體積，0.1mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
5：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，5×106 個(gè)。

注意事項(xiàng)
1、加入提取液離心后的上清若為渾濁為正?，F(xiàn)象。
2、提取過(guò)程嚴(yán)格在冰浴條件下進(jìn)行。
3、用微量石英比色皿測(cè)量的吸光值大于1.4 或者ΔA 測(cè)定大于1.2 時(shí)（石英96 孔板的吸光值大于1.4 或者ΔA 測(cè)定大于1.2 時(shí)），可以將樣品稀釋后進(jìn)行測(cè)定。若吸光值小于0.01，則可以增加反應(yīng)時(shí)間（5min 或10min）來(lái)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品需要增加同樣的反應(yīng)時(shí)間。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis》 作者:Meixi Peng, Dan Yang, Yixuan Hou, Shuiqing Liu, Maojia Zhao, Yilu Qin, Rui Chen, Yong Teng & Manran Liu 期刊:Cell Death & Disease 影響因子:5.959 PMID:30850587
《RIP3 inhibition protects locomotion function through ameliorating mitochondrial antioxidative capacity after spinal cord injury》 作者:Yang Wang，Jianhang Jiao，Shanyong Zhang，Changjun Zheng，Minfei Wu 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:3.743 PMID:31146112
《Cancer-Associated Fibroblasts Accelerate Malignant Progression of Non-Small Cell Lung Cancer via Connexin 43-Formed Unidirectional Gap Junctional Intercellular Communication》 作者:Luo M,Luo Y, Mao N, Huang G, Teng C,Wang H, Wu J, Liao X, Yang J 期刊:Cellular Physiology and Biochemistry 影響因子: PMID:30453281
《Cell death induced by α-terthienyl via reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the midgut of Aedes aegypti larvae》 作者:JieZhangaShakilAhmadaLan-YingWangaQianHanbJian-ChunZhangaYan-PingLuo 期刊:Free Radical Biology and Medicine 影響因子:5.657 PMID:31022448

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